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Milieux de culture


Date de la dernière modification
: 15-04-2017  

Agar-agar ou gélose - Bleu de méthylène - Bouillon et gélose nutritifs - Carmin - Eau de Javel - Éosine - Iode - lugol - Milieu au BCP - Milieu de Chapman - Milieu de Mueller Hinton - Milieu EMB - Milieu gélose glucose - Milieu LB ou Luria Bertani ou Lysogeny Broth - Milieu MRS - Milieu pour culture in vitro de végétaux - Milieu total - Peptone - Réactif de Schiff - Rouge neutre -

1) BLEU DE MÉTHYLÈNE 

   Colorant basique de la classe des thiazines. (Chlorure de tétraméthylthionine ou méthylthioninium). Il se présente sous la forme d'une poudre cristalline d'un bleu sombre, à reflets cuivrés, soluble dans 20 parties d'eau, moins soluble dans l'alcool.

   C'est un bon antiseptique à usage interne (capsules ou pilules enrobées de gluten) et externe (solutions pour badigeonnages et bains, collyres dilués au 1/500e). Vendu en pharmacie sous le nom de "Collubleu".

En biologie : le bleu de méthylène est un colorant extrêmement pratique pour étudier les cellules en milieu aqueux. Il s'agit d'un colorant vital, c'est-à-dire susceptible d'être utilisé sur des cellules vivantes. En fait, comme tous les colorants, c'est une substance toxique mais qui, lorsqu'elle est utilisée à très faible concentration, ne modifie pas notablement la vitalité d'une cellule et n'altère pas sa structure.

   Ce colorant se fixe essentiellement sur le noyau, plus exactement sur les éléments réfringents qui constituent la chromatine du noyau. Peu à peu, la coloration bleue du noyau s'intensifie et la vitalité de la cellule diminue. La chromatine qui réagit avec le bleu de méthylène basique est donc une substance basophile.      Haut de page.


2) IODE - LUGOL

   L'iode se présente sous forme de paillettes micacées, noir bleuâtres, fusibles à 114°C. Il bout à 184°C mais émet des vapeurs violettes, même à la température ordinaire.

   Il est peu soluble dans l'eau (1 pour 7000), qu'il colore en jaune, plus soluble dans l'alcool et très soluble dans l'acétone et dans les solutions aqueuses d'iodures alcalins. L'iode est très utilisé en médecine (teintures) et dans l'imagerie médicale (scanner).

LUGOL ou SOLUTION IODO - IODURÉE

   Très soluble dans l'eau, c'est le colorant que l'on utilise en biologie. Cette solution a la fâcheuse propriété de s'altérer à l'air et à la lumière en formant des flocons bruns. (Iode : 8 g  -  Iodure de potassium : 12 g  -  Eau distillée : 200 cm3  -  Faire d'abord la solution d'iodure de potassium et ajouter l'iode ensuite).

   Le lugol colore les membranes cellulaires et les noyaux en brun, le cytoplasme en jaune, les amidons en bleu. Il est également utilisé dans la coloration de Gram des bactéries.      Haut de page.


3) ROUGE NEUTRE (ou rouge de toluylène) 

   C'est une matière colorante du groupe de la phénazine (ou diphéno-para-diazine). C'est le monochlorhydrate de diméthyl-diamino-tolu-phénazine. Produit cristallisé, vert mordoré, soluble dans l'eau et l'alcool en donnant une liqueur rouge, virant au jaune par les alcalis.

 A reçu divers emplois en bactériologie, en particulier pour la recherche des bactéries du groupe coli-typhique dans l'eau et pour la coloration du gonocoque.

   Le rouge neutre est utilisé dans le traitement des affections de la cornée et de la kératite ulcéreuse, en solution à 5%. Il sert également à distinguer le lait de femme du lait de vache.

   En cytologie, c'est un colorant vital qui pénètre dans la cellule végétale sans lui être toxique. Il est très utilisé pour visualiser les grandes vacuoles et leurs variations de taille pendant les phénomènes de plasmolyse, turgescence, déplasmolyse. C'est aussi un bon colorant pour l'observation vitale des protozoaires.      Haut de page.


4) ÉOSINE 

   Tétrabromofluorescéine découverte en 1873 par CAYA. L'éosine est un colorant acide rouge obtenu par action du brome sur la fluorescéine. On l'utilise soit en solution alcoolique, soit en solution aqueuse en présence d'alcali.

   Le produit commercial est le sel de sodium rouge, soluble dans l'eau. La solution d'éosine est dichroïque : rouge par transparence, jaune verdâtre par réflexion.

   Ses utilisations sont nombreuses, bien qu'elle soit sensible à la lumière. On l'emploie notamment pour la fabrication de certaines encres rouges.

* En dermatologie, elle est utilisée en solution alcoolique comme antiseptique.

* En cytologie, elle colore le cytoplasme en rose et peut être associée à d'autres colorants (hématoxyline par exemple). Achat en pharmacie.      Haut de page.


5) CARMIN 

   De la femelle de cochenille "vraie", on extrait l'acide carminique, dont le décocté aqueux, traité par l'alun, précipite une belle poudre rouge qui est le carmin.

   On s'en sert en cytologie pour colorer le phloème (ou liber) en rose, associé au vert d'iode, ainsi que pour la coloration des chromosomes, en présence d'acide acétique et de fer. 

PRÉPARATION DU CARMIN VERT D'IODE       

Solution de carmin : mettre 15 g de carmin aluné en poudre dans 250 mL d'eau distillée et chauffer à feu doux pour dissoudre le carmin.

 Solution de vert d'iode : c'est une solution à 1%. Mettre 0,25 g de vert d'iode dans 25 mL d'eau distillée. Remuer.

Après filtration de la solution de carmin, mélanger les deux solutions dans la proportion de 10 mL de solution de carmin aluné pour 1 mL de solution de vert d'iode. Pour cela, verser lentement les 25 mL de solution de vert d'iode dans 250 mL de solution de carmin, tout en agitant. Ajouter quelques gouttes de phénol - achat en pharmacie - (attention ! produit dangereux pour la peau - vapeurs toxiques) comme antiseptique, à raison de 1 à 2 grammes pour les quantités ci-dessus. 

PRÉPARATION DU CARMIN ACÉTIQUE 

Dans un mélange à 50% d'eau distillée et 50% d'acide acétique, on verse une pincée de carmin d'alun en poudre. Ébullition pendant 5 minutes pour obtenir la saturation, puis filtration.      Haut de page.


6) RÉACTIF DE SCHIFF 

   C'est une solution de fuchsine basique décolorée (= leucodérivé) par l'action du gaz sulfureux, et qui est utilisée dans la réaction de Feulgen.

RÉACTION DE FEULGEN 

   Elle est utilisée pour la localisation directe de l'ADN (acide désoxyribonucléique) qu'elle colore en rouge. C'est ainsi que la chromatine qui en contient beaucoup est Feulgen +, alors que les nucléoles qui en général n'en contiennent pas (ils sont très riches en ARN) sont Feulgen -.

   La réaction positive de Feulgen correspond en réalité à la coloration en rouge du réactif de Schiff par les acides désoxyribonucléiques, après une hydrolyse ménagée (HCl normal à 60°C).

   Celle-ci arrache les bases puriques, et les groupements réducteurs du désoxyribose ainsi libérés, manifestent des propriétés d'aldéhyde que n'ont pas ceux du ribose : ils colorent donc le réactif de Schiff, ce qui permet la localisation et le dosage colorimétrique (histophotométrie des ADN, qui utilise une enzyme : la désoxyribonucléase).

   En analyses biologiques, le réactif de Schiff est utilisé pour les glucidogrammes (dosage des glycoprotéines). Dans la méthode P.A.S., le réactif de Schiff se colore en rouge en présence des aldéhydes qui apparaissent quand les sucres sont attaqués par l'acide périodique. 

PRÉPARATION DE LA FUCHSINE BASIQUE INCOLORE OU RÉACTIF DE SCHIFF 

- Réduire en poudre 0,5 g de fuchsine basique en cristaux (fuchsine diamant) et placer cette poudre au fond d'un ballon.
- Verser ensuite 100 cm3 d'eau distillée bouillante.
- Bien agiter et laisser refroidir jusqu'à 50°C.
- Filtrer et ajouter ensuite au filtrat 10 cm3 d'HCl normal. Pour préparer cet HCl normal : 82,5 cm3 d'HCl pur (d = 1,19) pour 100 cm3 d'eau distillée.
- Ajouter 0,5 à 2 g de métabisulfite de potassium en cristaux.
- Laisser en bouteille bien bouchée, à l'obscurité et au frais. Après 24 heures, la solution est jaune paille. Si on tient à ce qu'elle soit incolore (ce qui n'est pas indispensable), on peut la passer sur du charbon végétal.

Remarque : parfois, la solution se recolore spontanément ; il suffit alors d'ajouter 1 ou 2 grammes de métabisulfite de potassium pour que tout rentre dans l'ordre.      Haut de page.


7) PEPTONE
 

   Mélange de polypeptides et d'acides aminés, produit de la digestion artificielle et partielle de la viande (ou autres albuminoïdes) par la pepsine en milieu acide, ou par la pancréatine en milieu neutre.

   En concentrant le liquide provenant de ces digestions, on obtient la peptone liquide et, par évaporation (60°C sous vide), la peptone sèche qui représente environ 6 fois son poids en viande.

   La peptone est très soluble dans l'eau. Prix modique en pharmacie. Ce produit est utilisé dans de nombreuses préparations en microbiologie (milieux de culture).      Haut de page.


8) AGAR AGAR ou GÉLOSE

Origine du mot : Malaisie. C'est un mucilage extrait d'algues floridées des mers asiatiques, vendu en pharmacie et dans les hypermarchés, en rouleaux, en poudre ou en rubans jaunâtres, translucides et qui trouve de nombreuses utilisations :

- en pâtisserie pour la confection des flancs,
- en papeterie où il sert d'apprêt,
- dans l'industrie des tissus,
- en pharmacie comme agent émulsionnant et laxatif,
- en bactériologie pour la confection des milieux de culture (poudre).

*  L'agar agar gonfle dans l'eau et s'y dissout à l'ébullition (l'idéal est d'utiliser un four à microondes). Au refroidissement, la solution se prend en gelée (ou gélose) assez consistante si la dose d'agar agar atteint au moins 15 G PAR LITRE. Ce produit est aussi très largement utilisé en médecine.

*  Réduit en paillettes ou en poudre, ingéré au cours des repas, il produit, en se gonflant, une distension du bol alimentaire qui a pour effet de faciliter l'action des sucs digestifs, d'augmenter le péristaltisme et, par effet de conséquence, d'empêcher la constipation.

*  Pour le pansement et la protection de la muqueuse gastrique en cas d'hyperacidité, la gélose peut remplacer les sels de bismuth.

*  En dermatologie, elle est utilisée comme excipient non rétractile.

*  Très largement employé en microbiologie, l'agar agar sert à gélifier tous les milieux de cultures en boîtes de Pétri ou tubes inclinés.      Haut de page 


9) EAU DE JAVEL  (pH 11,5 à 12,5)

   La "Manufacture pour les acides et les sels minéraux" créée dans le village de Javel par le Comte d'Artois, se préoccupait des problèmes de blanchiment que les lavandières résolvaient en étendant leur linge sur les prés, au bord de la Seine toute proche.

   Le chimiste français BERTHOLLET finit par s'apercevoir que c'est l'oxygène de l'air, transformé en ozone par l'action du soleil, qui était à l'origine du blanchiment. Il chercha donc un corps chimique de remplacement qui produise un dégagement d'oxygène. Ce dégagement, il devait l'obtenir avec du chlore.

   Il mélangea de l'oxyde de manganèse, du sel marin et de l'eau acidulée par l'acide sulfurique et obtint un dégagement de chlore. L'eau de Javel était née. On est en 1785. Son succès s'étend rapidement à toute l'Europe.

   Plusieurs chimistes améliorent le procédé et ne tardent pas à découvrir le pouvoir désinfectant et l'action bactéricide qu'exerce l'eau de Javel. En 1920, le pharmacien Labarraque étudie et utilise les applications médicales du produit, qu'il fabrique selon une formule beaucoup plus diluée que l'on appelle bientôt "l'eau de Labarraque".

   En 1893, Chamberland et Fernbach, collaborateurs de Pasteur, constatent, dans les annales de l'Institut, que l'eau de Javel est capable de détruire très rapidement les spores du charbon, cette terrible maladie qui décime les troupeaux, et le microbe de la fièvre typhoïde.

   Introduit dès la fin du XIXe siècle dans les hôpitaux, l'emploi de l'eau de Javel y est généralisé au début du XXe siècle. Le produit sert à aseptiser les linges contaminés, les eaux suspectes et, grâce aux travaux du Dr. Bezançon, les plaies accidentelles.

   Berthollet n'avait pas prévu toutes les utilisations de son eau-miracle, dont le procédé de fabrication est aujourd'hui bien différent de celui qu'il employait.

L'eau de Javel est une solution d'hypochlorite de soude, contenant du sel ou chlorure de sodium, 
plus ou moins diluée dans de l'eau.  

  Même si elle a été remplacée en milieu hospitalier par d'autres produits (notamment pour désinfecter les linges et bâtiments), elle continue à être utilisée pour :

*   le nettoyage et la désinfection des cuisines, salles de bain, poubelles ...
*   la désinfection des piscines (1 litre d'eau de Javel pour 40 m3)
*   chasser les fourmis et parasites des placards des appartements (1 volume pour 5 volumes d'eau)
*   le blanchiment du linge (2 cuillerées à soupe d'eau de Javel à 12° chlore pour un litre d'eau froide, 1 cuillerée pour  
    un litre d'eau à 60° chlore)
*   désodoriser les litières des chats qui aiment cette odeur
*   l'eau des fleurs coupées, à raison de 4 à 5 gouttes par litre d'eau, ce qui prolonge la vie des fleurs ...
*   la destruction des germes en microbiologie et plus particulièrement en bactériologie.

IMPORTANT : les extraits d'eau de Javel doivent être dilués dans un délai de 2 mois à partir de la date de fabrication.                                          
La solution peut ensuite être conservée pendant plusieurs mois, au frais et à l'abri de la lumière.

L'extrait d'eau de Javel qui est une eau de Javel concentrée, titre environ 30° chlorométrique, c'est-à-dire qu'il peut dégager 95 à 100 g de chlore actif par litre. L'eau de Javel "normale" est 6 à 8 fois moins concentrée que cet extrait. 

Un dérivé de l'eau de Javel : la solution de Dakin, est toujours largement utilisé en chirurgie, pour le lavage et l'irrigation continue des plaies profondément infectées, car sa neutralisation en fait une solution qui n'altère pas les tissus, même après plusieurs heures d'utilisation continue.        Haut de page.

10) MILIEU GÉLOSE GLUCOSE 

Vendu dans le commerce sous le nom de "milieu Sabouraud".

PRÉPARATION 

   Dans 1000 cc d'eau distillée, verser 40 g de glucose, 10 g de peptone, 15 g de gélose (ou agar agar) - en poudre de préférence. Porter le tout à ébullition, laisser refroidir et, avant solidification, verser le mélange dans des récipients type erlenmeyer (ils seront bouchés avec un tampon de coton) ou dans des tubes avec bouchon à vis.

   Ces récipients (attention : les bouchons à vis ne doivent pas être vissés à fond) seront ensuite placés dans une étuve à 120°C pendant 20 à 30 minutes. Laisser refroidir dans l'étuve ou l'autoclave, visser à fond les bouchons.

   Pour la conservation, ces récipients seront placés dans un réfrigérateur. Avant l'utilisation (dévisser un peu les bouchons à vis), les placer dans un bain marie bouillant jusqu'à liquéfaction puis répartir le milieu gélose glucose dans des boîtes de Pétri, en restant dans la zone de stérilité d'un bec bunsen. 

UTILISATION

Ce milieu convient très bien pour la culture des levures - Saccharomyces - et des moisissures - Penicillium, Aspergillum, Rhizopus nigricans ...  (25°C pendant 3 à 7 jours), ainsi que pour de nombreuses bactéries sans exigences particulières.       Haut de page.


11) MILIEU AU BCP (ou PBC)

PRÉPARATION 

   Dans 1000 cc (cm3) d'eau distillée portée à ébullition et constamment remuée, verser
- 10 g de glucose (ou de lactose),
- 5 g de peptone (pharmacie),
- 15 g d'agar agar (gélose) si l'on veut obtenir un milieu solide,
- 3 g d'extrait de viande (Viandox par ex.) et
- 0,025 g de pourpre de bromocrésol.

Laisser refroidir après 2 à 3 minutes d'ébullition. Verser la solution dans des récipients bouchés avec un tampon de coton. Pour les tubes à culture, ne pas serrer le bouchon à vis.

Stérilisation du milieu : voir page "stérilisation".

UTILISATION

   Ce milieu permet de mettre en évidence le métabolisme des bactéries qui utilisent le glucose et/ou le lactose. La réaction positive se traduit par un passage du violet au jaune du BCP, car le milieu devient acide.

   Simultanément, dans le cas du glucose, un gaz peut se dégager (bactéries "gaz +"). Il est alors recueilli dans une "cloche", petit tube placé dans le milieu liquide, ouverture vers le bas.     Haut de page. 


12) MILIEU DE CHAPMAN 

C'est un milieu hypersalé qui ne permet que le développement des bactéries halophiles, c'est-à-dire vivant normalement dans un milieu très salé. Il est utilisé pour la culture et l'isolement des staphylocoques

PRÉPARATION

Extrait de viande : 1 g
Chlorure de sodium (sel) : 75 g
Peptone : 10 g
Mannitol (*) : 10 g
Rouge de phénol : 0,025 g
Agar agar : 15 g
Eau distillée : 1000 mL

(*) Mannitol (ou mannite) : c'est un hexalcool : CH2OH - (CHOH)4 - CH2OH, rencontré dans de nombreux végétaux et notamment la manne (exsudation sucrée des feuilles) du frêne. La mannite ordinaire est dextrogyre et son oxydation fournit le  d-mannose ou le d-fructose. Elle a des propriétés laxatives.            Haut de page.


 13) MILIEU E.M.B. (Eosine-methylen-blue) 

UTILISATION

   C'est un milieu caractéristique d'Escherichia coli, sur lequel le colibacille forme des colonies de 2 à 3 millimètres, plates, d'un violet très foncé. Elles se distinguent également par des reflets métalliques "en dos de scarabée".

PRÉPARATION

- Peptone : 10 g
- Phosphate dipotassique (PO4 K2H) : 2 g
- Lactose : 10 g
- Éosine jaune (*) : 0,4 g
- Bleu de méthylène (*) : 0,065 g
- Agar agar : 15 g
- Eau distillée : 1000 mL
- Les deux colorants (*) sont des inhibiteurs des bactéries Gram +
- Le pH final de ce milieu est égal à 6,8.

   Cette culture se fait pour la recherche d'Escherichia coli dans des infections génitales, urinaires, biliaires et intestinales, en particulier des gastro-entérites infantiles qui peuvent être graves. Chez les nourrissons, il peut y avoir septicémie et méningite.  Haut de page.


14) MILIEU "TOTAL" 

Facilement réalisable au laboratoire, sous réserve d'observer quelques précautions indispensables concernant la stérilisation. Se procurer dans le commerce des bâtonnets de "KUB-OR" ou "FONDOR" (MAGGI). 

PRÉPARATION

Mélanger 1 bâtonnet dans 1/2 litre d'eau
- Rajouter 10 g de sucre pour 1 litre de mélange (glucose, sinon : 2 morceaux)
- Pour un milieu solide, 15 g d'agar agar
- Porter à ébullition en remuant et laisser refroidir.

   Si on utilise le milieu dans la demi-journée, pas de précautions particulières. Pour une conservation de longue durée : méthode de Tyndall (Tyndallisation)

- Répartir le milieu dans des tubes fermés par des tampons de coton.
- 1/2 heure d'ébullition au bain marie (ce qui tue les formes végétatives, mais pas les spores)
- Laisser refroidir dans le bain marie.
- Le lendemain, les spores auront germé. Même opération.
- Le surlendemain, même opération.

Remarque : on peut utiliser une cocotte-minute (110°C). Il suffit alors d'une ébullition pendant 30 minutes.    

Levures : on peut utiliser la même base que ci-dessus, mais il faut 50 à 60 g de glucose par litre de milieu.     Haut de page.



15) BOUILLON NUTRITIF - GÉLOSE NUTRITIVE 

   Ce milieu permet de cultiver la plupart des germes qui n'ont pas d'exigences particulières. C'est également une base intéressante à laquelle on pourra rajouter divers produits (exemple : du glucose pour la culture des levures) en fonction des germes à cultiver.

PRÉPARATION

- Peptone : 6 g
- Extrait de levure : 3 g
- Eau : 1000 mL
- Pour un milieu solide : agar agar 15 g  

Pour la conservation du milieu, procéder comme d'habitude, c'est-à-dire par tyndallisation, ou 20 minutes à l'autoclave (120°C), ou 30 minutes dans une cocotte-minute 110°C). Ne fermer les bouchons à vis qu'après refroidissement complet des tubes. Remarque : ce milieu de culture est en vente (petits conditionnements en poudre) dans les commerces spécialisés (Jeulin, Pierron ...) sous le nom de "Bouillon nutritif" ou "Gélose nutritive".       Haut de page.


16) MILIEU DE MUELLER HINTON 

PRÉPARATION

Les proportions ci-dessous sont calculées pour 1000 mL d'eau distillée.
- Infusion de 300 grammes de viande de bœuf déshydratée.
- Hydrolysat acide de caséine : 17,5 g
- Amidon de maïs : 1,5 g
- Agar agar : 10 à 15 g
- pH final du milieu : 7,4

Porter le tout à ébullition et verser le milieu dans les tubes avant qu'il ne se solidifie.

UTILISATION

Le milieu de Mueller Hinton doit obligatoirement être employé pour les antibiogrammes (normes de l'O.M.S.) Il va de soi que l'on peut l'acheter prêt à l'emploi.

Si on le confectionne soi-même, on stérilise les tubes sans attendre : 20 minutes à l'autoclave à 120°C ou 30 à 40 minutes dans une cocotte-minute à 110°C, bouchons non serrés. Si cette stérilisation est faite correctement, les tubes se conservent sans problème jusqu'à l'année suivante.    Haut de page.


17) MILIEU M.R.S. (Man, Rogosa et Sharpe) 

UTILISATION

   Avec le lait, c'est le meilleur milieu pour cultiver les lactobacilles, qui sont en général acidophiles et cultivent d'autant mieux que le milieu a déjà été acidifié par l'action des streptocoques lactiques.  

PRÉPARATION

- Peptone : 10 g
- Extrait de viande : 10 g 

- Extrait de levure : 5 g
- Glucose : 20 g
- Tween 80 : 1 mL
- Acétate de sodium : 5 g
- Citrate d'ammonium : 2 g
- Phosphate monoacide de potassium : 2 g
- Sulfate de manganèse : 0,05 g
- Sulfate de magnésium : 0,20 g
- Eau distillée : 1000 mL

   Le pH final de ce milieu doit être compris entre 6,5 et 6,9. Pour un milieu solide, on ajoute 15 g d'agar. Puis répartition dans des tubes de stérilisation.        Haut de page.


18) MILIEU pour CULTURE IN VITRO de végétaux 

LE MATÉRIEL  (d'après Catherine Variet-Coeffler, lycée Charles de Gaulle, CAEN)

- Eau distillée
- Gélose  (chez Prolabo : réf. 20 768 235)
- KOH 1N (id. : réf. 32 058 608)
- Saccharose (id. : réf. 27 478 296)
- Auxine : NAA (naphtalene acetic acid) (Sigma : réf. N0640)
- BAP (6-benzylaminopurine) (Sigma : réf. B9395)
- Milieu minéral "Murashige Skoog" sels et vitamines (id. : réf. M6899)
- Petits pots de bébé et capsules (caps)
- 1 bécher de 1 L
- 2 flacons à vis de 100 mL
- 1 pipette de 0,1 mL
- 1 vaporisateur à main
- Balance de précision (assez précise pour mesurer exactement 100 mg)
- pH-mètre mesurant à 0,1 unité près
- Autoclave ou autocuiseur "cocotte-minute" pour stérilisation humide
- Réfrigérateur, congélateur
- Étuve pour stérilisation à sec de la verrerie ou four à microondes
- Miniserre, pots, terreau
- Éventuellement boîte à manipulations à UV ou hotte à flux laminaire
- Chambre de culture ou aquarium adapté à cette fin    Haut de page

PRÉPARATION  DES MILIEUX DE CULTURE

1° Les hormones

    * La solution de BAP à 1 g/L

        - Dans un bécher, dissoudre 100 mg de BAP dans 10 mL de KOH sous agitation magnétique
        - Compléter avec de l'eau distillée jusqu'à 100 mL

   * La  solution d'auxine à 1 g/L

        - Même préparation

   * Les 2 solutions se conservent au froid et à l'obscurité pendant 1 an

2° Préparer les milieux à implanter

   * Préparer 1 L de Murashige et Skoog solution fille
      - Y ajouter 30 g de saccharose + O,1 mL de solution mère de BAP + 1 mL de solution mère d'auxine
      - Ajuster le pH entre 5,5 et 6
      - Ajouter 7,5 g de gélose, chauffer 5 min environ à 80°C jusqu'à dilution complète
      - Verser dans les pots de bébé (20 mL par pot) ; fermer avec les capsules

   * Stériliser : autoclave ou autocuiseur (20 min après la mise en rotation de la soupape)
      - Puis laisser refroidir
      - Vérifier la fermeture des capsules
      - Conserver au réfrigérateur

3° Préparer le milieu de repiquage

(Au moment de l'utilisation)

Même préparation que celle des milieux à implanter, mais :
- pas d'hormones
- diluer de moitié le Murashige et Skoog   
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19) MILIEU LB ou milieu Luria Bertani ou milieu Lysogeny Broth

    Pour la petite histoire, le milieu LB est appelé à tort milieu Luria Bertani, du nom de 2 biologistes qui ont eu leurs heures de gloire dans les années 1940 à 50 : Salvador LURIA et Giuseppe BERTANI. Selon les dires de l'un d'eux il s'agit d'une confusion, les lettres LB signifiant à l'origine Lysogeny Broth, c'est-à-dire bouillon de culture pour l'étude de la lysogénie. Mais dans la plupart des publications scientifiques, milieu LB est aujourd'hui synonyme de milieu Luria Bertani ou de Luria Broth.
    En principe, il s'agit d'un milieu liquide. Pour un milieu solide, on utilise "LB agar", ou LBA (Luria Broth Agar) c'est-à-dire le même que précédemment auquel on additionne 15 à 20 g de gélose (agar agar) selon le résultat désiré. Le milieu ainsi gélosé est placé en étuve à 121°C pendant 20 minutes, puis laissé à refroidir jusqu'à 50°C environ (*) avant d'être coulé en zone stérile dans les boîtes de Pétri. (*) Le fait de ne couler le milieu qu'à une t° d'environ 50°C va limiter la formation de buée dans les boîtes de Pétri.

   Plus de détails sur le milieu LB liquide : pour * 1 litre d'eau déminéralisée * 10 g de Tryptone * 5 g d'extrait de levure * 5 g de sel NaCl. Si on commande les produits lyophilisés, on peut aussi mélanger 25g de milieu LB Broth, parfois appelé milieu Miller, avec 1L eau déminéralisée. Faire ensuite l'autoclavage comme indiqué ci-dessus.     Haut de page.

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